FlowJo是一款專業(yè)的流式細(xì)胞分析專業(yè)軟件，F(xiàn)lowJo能兼容幾乎所有流式儀器采集的數(shù)據(jù)，通過圖像分析細(xì)胞的各種變化。FlowJo簡(jiǎn)單易用，功能強(qiáng)大，真實(shí)的模擬數(shù)據(jù)支持，采用色彩豐富的二維圖進(jìn)行系統(tǒng)分析，幫助用戶輕松了解了解細(xì)胞的狀態(tài)變化擁有流動(dòng)室和液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，光電轉(zhuǎn)換器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)。

FlowJo功能

1.單標(biāo)樣本

單標(biāo)記樣本數(shù)據(jù)常用的顯示方式是單參數(shù)直方圖。通常橫坐標(biāo)可以是線性標(biāo)度或?qū)?shù)標(biāo)度，代表著所檢測(cè)的熒光或散射光的強(qiáng)度；縱坐標(biāo)表示的是橫坐標(biāo)某一特定熒光強(qiáng)度的細(xì)胞數(shù)，有時(shí)也用相對(duì)百分比來表現(xiàn)。

以3 color comp 文件夾中的CyPE comp.fcs進(jìn)行分析演示。將此文件夾移至桌面，并把該數(shù)據(jù)文件夾從桌面拖入Flowjo中的組空間中。

在組空間中單擊選中“3 color comp”組，此時(shí)在樣本空間里顯示“3 color comp”組中的所有樣本。而后在樣本空間中雙擊“Cy5PE comp.fcs”，出現(xiàn)圖形窗口。

此為二維點(diǎn)圖，X軸選擇SSC（側(cè)向散射，細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，質(zhì)量越大，SSC越大，反之越小。）Y軸選擇FSC（前向散射，細(xì)胞越大，F(xiàn)SC越大；反之越小。）

選擇設(shè)門工具（矩形門、橢圓門、多邊形門、自動(dòng)門）中的任意一個(gè)，在二維點(diǎn)圖中選中淋巴細(xì)胞。

在圖形窗口中雙擊選中的淋巴細(xì)胞，生成新的圖形窗口。在X軸選擇Cy5PE:CD4，Y軸選擇Histogram，選擇設(shè)門工具（區(qū)域門、雙分門）中任意一個(gè)，在單參數(shù)直方圖中設(shè)門。

2.多色標(biāo)樣本

多色標(biāo)記樣本，包含雙標(biāo)記、三標(biāo)記及以上的樣本。橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)分別代表與細(xì)胞有關(guān)的兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)，平面上的每一個(gè)點(diǎn)表示具有相應(yīng)坐標(biāo)值的細(xì)胞。

以三標(biāo)記樣本為例，選擇3-color-experiment文件夾中的931115-B02-Sample01.FCS進(jìn)行分析演示。同樣，在在樣本空間中雙擊“931115-B02-Sample01.FCS”樣本，出現(xiàn)圖形窗口，顯示為二維點(diǎn)圖。X軸選擇FSC，Y軸選擇SSC。然后選擇多邊形設(shè)門工具，在二維點(diǎn)圖中選中淋巴細(xì)胞。

雙擊淋巴細(xì)胞門，出現(xiàn)圖形窗口，X軸選擇Fluor::CD3，Y軸選擇FSC。使用矩形設(shè)門工具選中CD3陽性細(xì)胞，設(shè)門并命名為T細(xì)胞。

雙擊T細(xì)胞門，出現(xiàn)圖形窗口，在X軸選擇Cy5PE::CD4，Y軸選擇PhyEry::CD8，使用十字門工具設(shè)門（拖動(dòng)鼠標(biāo)將四分門移到目標(biāo)位置即可，一般根據(jù)細(xì)胞分群的趨勢(shì)，四分門的界定線可設(shè)在陰性、陽性細(xì)胞的分群處），如下圖所示：

Q1：CD8單陽性細(xì)胞，為CD8+ T細(xì)胞

Q2：雙陽性細(xì)胞

Q3：CD4單陽性細(xì)胞，為CD4+ T細(xì)胞

Q4：雙陰性細(xì)胞

3.細(xì)胞凋亡（Cell apoptosis）

拖入凋亡樣本，雙擊原始數(shù)據(jù)打開圖形窗口。X軸選擇FSC-A，Y軸選擇SSC-A。分析凋亡的細(xì)胞選擇上圖所示的細(xì)胞群體進(jìn)行分析。細(xì)胞碎片不予分析。

在SSC/FSC圖中雙擊“分析的細(xì)胞群體”，X軸選擇FITC,用來表示AnnexinV-FITC。Y軸選擇PE-Texas,用來表示PI。用四分門設(shè)門工具界定活細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。如下圖所示：

Q1：(AnnexinV-FITC)-/PI+，此區(qū)域的細(xì)胞為壞死細(xì)胞。也可能有少數(shù)的晚期凋亡細(xì)胞在其中，甚至機(jī)械損傷的細(xì)胞也包含其中。

Q2: (AnnexinV+FITC)+/PI+，此區(qū)域的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞。

Q3：(AnnexinV-FITC)+/PI-，此區(qū)域的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞。

Q4：(AnnexinV-FITC)-/PI-，此區(qū)域的細(xì)胞為活細(xì)胞。

通常統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率時(shí)采用Q2+Q3，晚期凋亡＋早期凋亡群（即所有AnnexinV陽性群）。

4.細(xì)胞周期（Cell Cycle）

細(xì)胞周期的檢測(cè)是流式細(xì)胞儀最為廣泛的應(yīng)用之一。細(xì)胞周期是指以有絲分裂方式增殖的細(xì)胞從親代分裂結(jié)束到子細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程。通常由G1期、S期、G2期和M期組成。細(xì)胞在G1期完成必要的生長和物質(zhì)準(zhǔn)備，在S期完成染色體DNA的復(fù)制，在G2期進(jìn)行必要的檢查和修復(fù)，以保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。在M期完成遺傳到子細(xì)胞中的均等分配，使細(xì)胞進(jìn)行分裂。

細(xì)胞周期檢測(cè)中PI最為常用。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與DNA的含量成正比例關(guān)系，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，就可以得到細(xì)胞周期各個(gè)階段的DNA分布狀態(tài)，從而計(jì)算出各個(gè)期的百分含量。

以cell cycle 文件夾中的5206.001，PI標(biāo)記為例，設(shè)門選取目標(biāo)細(xì)胞群體，將細(xì)胞碎片排除在外。即雙擊工作臺(tái)中的5206.001樣本，打開圖形窗口。X軸選擇FSC-H，Y軸選擇SSC-H，細(xì)胞碎片位于左下角的位置，設(shè)門選中目標(biāo)細(xì)胞，如下圖：

設(shè)門選中要進(jìn)行細(xì)胞周期分析的單細(xì)胞群體，排除粘連細(xì)胞（粘連在一起的雙細(xì)胞或多細(xì)胞團(tuán)塊等）的影響。X軸選擇FL2-W(width)，Y軸選擇FL2-A(area)，設(shè)門方式如下圖：

BD的流式儀采集的數(shù)據(jù)：在進(jìn)行周期分析的時(shí)候，通常是采用FL2-A與FL2-W（或者FL2-A與FL2H）進(jìn)行設(shè)門。

Beckman的流式儀采集的數(shù)據(jù)：X軸選擇FL3-LIN,用來表示PI的線性信號(hào)。Y軸選擇FL3-PEAK,用來表示PI的峰值信號(hào)。設(shè)門方式如下圖：

在FlowJo工作臺(tái)中選中“單細(xì)胞群體”這個(gè)節(jié)點(diǎn)，在菜單欄的“工具”中選擇“細(xì)胞周期”，打開周期分析窗口。得到G1期、S期、G2期細(xì)胞百分比，G1期CV值和G2期CV值等數(shù)據(jù)。

圖中粉色的曲線是周期擬合的模型曲線，黑色的為樣本曲線。理想狀況是粉色和黑色曲線吻合一致為最佳。擬合的好壞可以根據(jù)右邊的RMS值來判斷。RMS(root mean square error)值越小越好，當(dāng)周期擬合的不好的時(shí)候，可以通過更換擬合模型（Watson和Dean-Jett-Fox）或者更改限制條件確保（G1是G2的兩倍）進(jìn)行調(diào)整。

而G1/S/G2百分比：G1/S/G2期細(xì)胞所占的百分比。G1/G2均數(shù)：G1/G2期細(xì)胞熒光強(qiáng)度的平均數(shù)。CV（Coefficient of Variation，變異系數(shù)）：儀器因素和樣品制備及染色過程對(duì)標(biāo)本的人為影響。通常G0/G1峰的CV來檢測(cè)分辨率或精度。G1 cv/G2 cv：G1/G2峰的變異系數(shù)，其大小反映了G1/G2峰的寬度，數(shù)值越小，峰越窄。

FlowJo 處理流式數(shù)據(jù)簡(jiǎn)單易學(xué)，而且TOP10 免疫學(xué)期刊上的文章大多數(shù)都是用 FlowJo 分析數(shù)據(jù)。使用好FlowJo對(duì)發(fā)高分文章會(huì)有很大的幫助。

安裝方法

首先安裝主程序 ，安裝完成后先不要打開。插上U盤，運(yùn)行注冊(cè)機(jī)，自動(dòng)識(shí)別到U盤，點(diǎn)擊下方【Generate license above device!】會(huì)自動(dòng)在U盤中生成一個(gè) license.key 文件。

運(yùn)行軟件，選擇【Use a hardware-based license (dongle)】后點(diǎn)擊【Done】按鈕即可。



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